严重脓毒症和感染性休克患者血管生成介质内皮因子、肝素结合表皮生长因子样生长因子、骨形成蛋白-9和成纤维细胞生长因子-2的循环水平
宿迁市人民医院许可 摘译
Circulating levels of the angiogenesis mediators endoglin, HB-EGF, BMP-9 and FGF-2 in patients with severe sepsis and septic shock
Vanessa Boury Faiotto, Daniel Franci, Rodolfo Monteiro Enz Hubert, Gleice Regina de Souza, Maiara Marx Luz Fiusa, BidossessiWilfried Hounkpe, Thiago Martins Santos, Marco Antonio Carvalho-Filho, Erich Vinicius De Paula
J Crit Care. 2017 Jul 17;42:162-167.
摘要
目的：内皮屏障功能障碍是脓毒症的一个标志，且至少部分是由血管生成过程中调控内皮屏障的信号通路来介导。因此，有报道血管生成相关的关键蛋白如血管内皮细胞生长因子-A和促血管生成素-2在脓毒症中表达水平增加也就不足为奇了；本研究的目的在于探讨是否有在血管生成过程中调控内皮屏障完整性的其他途径可能也参与了脓毒症的宿主反应中。
材料和方法：我们在一组50例严重脓毒症和感染性休克患者中评估了以前未在脓毒症研究中涉及的四种血管生成相关蛋白的循环水平。
结果：在患者和健康志愿者中骨形成蛋白-9（BMP-9）和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）的循环水平相似。相反，感染性休克患者的内皮因子（Endoglin）水平较健康人则高出1.5倍（P = 0.004），肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）则下降2倍（P = 0.002）。值得注意的是，近期研究表明肝素结合表皮生长因子样生长因子的缺失对脓毒症大鼠的生存起着决定性作用。
结论
内皮因子和HB-EGF可能参与脓毒症的宿主反应。 但需要进一步研究来探索它们在作为脓毒症生物学标志物及治疗靶点中的作用。
1. 研究背景
脓毒症是一种常见临床综合征，其特征是由感染引起的全身性炎症反应。虽然目前对脓毒症的认识及诊治上有很大的提高，但仍是医学届面临的巨大挑战之一，其死亡率为15%-60% [1,2]。
内皮系统激活是脓毒症的重要特征之一[3,4]。局部内皮系统激活对促进循环池中白细胞到达感染部位有重要作用，并且参与白细胞的募集、白细胞粘附到内皮以及迁移至感染的组织 [5]。 因此，这种趋向性和可调控的内皮屏障（EB）功能的破坏可以被认为是对入侵病原体的生理反应的一部分。然而在脓毒症中，广泛的及失调的内皮屏障破坏也可导致组织损伤，促进脓毒症相关并发症发生如：急性呼吸窘迫综合征和感染性休克[4-6]。事实上，已有研究报道，从人实验性内毒症血症中获取的血浆可使体外内皮细胞的通透性增加[7]。
过去几十年在细胞和动物模型中，内皮屏障功能的调节机制已得到详细阐述。这些信号通路在血管生成过程中被激活，这是内皮屏障功能短暂破坏、新生血管出芽形成所需要的一个过程。因此，可以推测这种参与内皮屏障完整性的生理调节的信号通路同样可能参与内皮屏障破坏的病理生理过程。事实上，一些证明上调关键的血管生成相关分子如VEGF和血管生成素水平上调的研究支持这一假设[9-11]， 也为将内皮屏障功能破坏作为脓毒症一个有希望的治疗靶点做好了准备 [12]。
近年来，一些参与血管生成和内皮屏障完整性的新的信号通路及蛋白被发现，但是它们在脓毒症中作用却未被研究。我们假设了其中一些通路参与脓毒症发生，进而参与内皮屏障功能的破坏。我们研究的目的是在严重脓毒症和感染性休克的患者中，评估调节血管生成和/或内皮屏障稳定性相关的4种蛋白的循环水平。
2. 材料和方法
2.1 研究对象
本研究采用来自巴西坎皮纳斯大学公共城市教学三级综合医院的严重脓毒症或感染性休克患者的样本，包括血液科及重症医学科在2012年1月至2013年3月期间患者；该研究对象大于18岁，符合脓毒症诊断标准及在入院前24小时内出现严重脓毒症或感染性性休克的迹象的患者[13,14]。 从献血站招募23名年龄匹配的健康志愿者；这项研究是按照“赫尔辛基宣言”进行的，并经医院伦理委员会批准。
2.2 定义、临床资料和脓毒症严重程度评分
脓毒症定义符合以下两个或两个以上条件：（1）体温>38℃或<36℃，（2）心率>90次/分，（3）呼吸频率>20次 /分或PaCO2 <32 mmHg，并且有病原学证据或临床上明显感染灶；感染性性休克：由于脓毒症引起的低血压，即使经初始液体复苏，收缩压<90 mmHg或从基线下降>40 mmHg等，初始液体复苏以30ml /kg的晶体（通常为2L）静脉输注，维持平均动脉压>65 mmHg；不能在一小时内达到这一目标，或者随时需要血管升压药物的确定为感染性休克。所谓严重的脓毒症定义，如前所述，为合并有器官功能障碍的脓毒症 [13-15]。所有关于病史、诊断、临床数据的描述性资料均来自病历记录；病情严重程度通过入组当天器官衰竭评估（SOFA）评分来评估。[20]
2.3 实验室检查
在发生严重脓毒症或感染性休克的24小时内，通过静脉穿刺或中心静脉导管获取静脉血；全血可在室温下放置30分钟，并在4℃ 1000g离心10分钟，分离血清，取出0.5ml冻存在-80℃直到分析；使用Milliplex MAP人血管生成生长因子磁珠试剂盒来测定内皮因子，成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），骨形成蛋白-9(BMP-9)和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的血清水平（Millipore公司，比尔里卡，马萨诸塞州，美国）。该方法使用标记特定荧光抗体的磁珠及能够同时测量样品中多种蛋白水平的生物素化检测系统，之前有研究验证了该方法的准确性[16,17]，而且该方法正越来越多应用于生物医学研究[18,19]。依据产品说明使用96孔板检测；简言之，样品和抗体包埋的磁珠在合适的缓冲液中稀释，4℃孵育12小时，洗涤3次，加入二抗，室温孵育1小时，加入链霉亲和素--藻红蛋白溶液作用30分钟。最后，再洗涤3次并重新悬浮液体，在Luminex 200系统中使用Luminex xPonent软件（EMD Millipore）分析样本；使用已知浓度的4个标准品的浓度曲线来计算样本浓度。另外，每个蛋白分子测定分别具有相对低和高水平两个质量控制数据；每孔36个不同点进行荧光计数，将其平均值作为最终结果。
2.4 分析特点
生产商对四种检测物中的每一种分别提供了组内和组间变异系数（CV％）分别为：内皮因子- 4.1％和6.4％；FGF-2 - 2.8％和7.1％； BMP-9- 4.6％和7.5％；HB-EGF - 3.8％和13.1％。最低检测值分别为：内皮因子- 22.6 pg / ml；FGF-2 - 10.5 pg / ml;；BMP-9-1.4pg / ml;；HB-EGF - 0.6 pg / ml。所有质控标本得结果均在预期有效范围。
2.5 统计学分析
采用描述统计报告患者和健康志愿者的人口学特征及临床资料；数据由中位数、四分位数、均值和标准差表示。根据入院时是否存在感染性休克，将患者分成2个组；应用Mann-Whitney检验分析来自患者各组之间和患者与健康对照之间的连续变量的差异。用Fisher精确检验比较各分类变量；对于每种蛋白浓度和SOFA评分之间进行Spearman相关分析。P£ 0.05有统计学意义。所有统计分析采用GraphPad Prism软件进行。（GraphPad Prism 软件公司，圣地亚哥，加州，美国）
3.研究结果
3.1 患者特点
本研究共纳入50例患者和23例健康志愿者。在性别方面，健康人与患者没有差异（男性:女性比例分别为15:8和33:17），但健康志愿者年龄（39.3±10.0岁）明显较患者年轻（56.4±17.1岁）（P£ 0.01；t检验）。患者的人口学及临床特点见表1。严重脓毒症或感染性休克患者比例为22:28（44.0％vs 56.0％）。入院时，严重脓毒症患者中位SOFA评分为8（4-19），感染性休克患者为13（5-21）（P = 0.0005）。感染性休克患者28天死亡率为64.3％，严重脓毒症
患者则为25.0％（OR 7.2；95％CI 1.9-25.3；P = 0.003），所有死亡归因于脓毒症并发症。
3.2 严重脓毒症或感染性休克患者BMP-9和FGF-2的血清水平
BMP-9血清水平在严重脓毒症患者（64.77pg / ml; 33.14-94.02），感染性休克患者（35.66pg / ml; 12.44-85.06）和健康志愿者（51.46pg / ml 32.34-68.98; P = 0.29）无差异。由于有几例患者未检测到的FGF-2水平，FGF-2的组间比较采用连续变量和分类变量；FGF-2水平在严重脓毒症患者（22.09pg / ml; 14.00-33.31），感染性休克患者（29.68pg / ml; 13.93-59.92）和健康志愿者（25.95pg / ml; 9.74-29.68; P = 0.63）（图1）无差异。同样，在严重脓毒症和感染性休克的患者（30/50）或健康个体（16/23; P = 0.60）各组中未检测到的FGF-2的比率相比无差异；对于BMP-9和FGF-2水平，即使将脓毒症和感染性休克患者合并为一组与健康志愿者相比，仍无显著性差异。
图1：BMP-9和FGF-2的血清水平。严重脓毒症患者，感染性休克患者和健康志愿者的BMP-9（a）和FGF-2（b）循环水平的点状图。 水平线表示中位数值。 Kruskall-Wallis检验。
3.3 严重脓毒症及感染性休克患者血清内皮因子和HB-EGF水平
对于血清内皮因子水平，感染性休克（1073 pg / ml; 823-1459）患者较水平健康志愿者（730 pg / ml; 544-883）显著升高（中位数，四分位数）（P = 0.004; Mann-Whitney检验）；严重脓毒症患者也表现出较高的内皮因子表达水平（1120 pg / ml; 522-1482），但与健康志愿者间相比差异无统计学意义（P = 0.06; Mann-Whitney检验）。而严重脓毒症和感染性休克患者相比无显著性差异（P = 0.96; Mann- Whitney检验）。三组之间的比较如图2所示。对于HB-EGF水平，与健康志愿者（247.0 pg/ml; 181.0-352.0）相比，在脓毒症患者（127.7 pg/ml; 80.3–174.0）和感染性休克患者（126.0 pg/ml; 31.9–233.5）中均显著降低（分别为P = 0.0003和0.002; Mann-Whitney检验）。在这两个亚组之间差异无统计学意义（P = 0.97），所有三组之间的比较如图2所示。
图2：:内皮因子和HB-EGF的血清水平。严重脓毒症，感染性休克和健康志愿者内皮因子（a）和HB-EGF（b）的循环水平的点状图。水平条表示中位数值。 Kruskall-Wallis检验与Dunn的多重比较检验。
3.4 血管生成调节分子与脓毒症严重程度间的相关性
在样本采集时，脓毒症严重程度SOFA评分与相关分子之间的无明显相关性；在HB-EGF和血小板计数之间观察到较强的正相关性（Rs = 0.56; P = 0.0001）（图3）。
图3：血清HB-EGF水平与血小板计数之间的相关性。 在血小板计数和HB-EGF水平之间观察到显著正相关（Spearman相关系数Rs0.56）。
4. 讨论
脓毒症发病机理的关键在于对病原体清除来说重要的细胞通路也参与了组织损伤和器官功能障碍[6,20]。其中一个典型例子即是血管生成及内皮屏障的破坏；这对于吞噬细胞迁移到感染组织中是必需的，同时也参与了依赖VEGF和Ang-2信号通路的感染性休克和急性肺损伤的发生[5]。我们研究的主要结果表明在血管生成中参与调节内皮屏障功能的另外两种蛋白质（内皮因子和HB-EGF）在严重脓毒症症和感染性休克的早期阶段也有不同程度的表达。
多项证据支持调控内皮屏障功能可能是脓毒症的一个具有吸引力的治疗靶点。在多种脓毒症的动物模型中均一致发现微血管通透性增加 [21,22]。参与调控内皮屏障功能的血管生成分子如VEGF-A和Ang-2在脓毒症患者中表达水平增加，且趋向于和脓毒症严重程度相关 [9,10,23,24]。最后，与内皮屏障稳定相关的分子在脓毒症模型中呈现了较为有希望的结果[25-27]。大部分研究集中在参与VEGF和血管生成素途径中的蛋白质和分子，这是胚胎期和出生后血管生成中内皮屏障功能的关键介质[8]。来自血管生成相关通路中的其他蛋白质分子在脓毒症内皮屏障功能破坏中的作用尚待明确。
内皮因子是TGF-β信号通路的成员，TGF-β是血管生成的重要通路之一[28]。它参与正常血管生成，正如被观察到的遗传性出血性血管扩张症（HHT）患者，由于ENG基因突变，该基因在毛细血管水平的血管畸形广泛存在 [29]。内皮因子被证实可促进内皮屏障功能破坏，这是正常血管生成的关键步骤[8]，同样也是感染性休克的重要标志 [5]。具体讲，可溶性内皮因子通过抑制TGF-β信号增加血管通透性[30]。内皮因子也可在非内皮细胞中表达，并参与脓毒症相关的其他生物学过程，该结果在最近使用内皮因子特异性基因敲除小鼠模型的研究中被证实；在本研究中，内皮因子缺乏使小鼠的软组织发生机会致病菌感染，主要由金黄色葡萄球菌导致巨噬细胞吞噬功能受损[31]。值得注意的是，内皮因子是可以被基质金属蛋白酶14（MMP-14）切割的跨膜蛋白[32]，因此在我们患者的血清中观察到的可溶内皮因子水平的增加可能是由于这种蛋白质的表达增加或脱落增加。内皮因子被认为是诊断先兆子痫诊断最有潜力的生物标志物之一[33]。据我们所知，循环内皮因子水平并没有在脓毒症或感染性休克患者中得到研究；我们的研究表明，与健康人相比，感染性休克和严重脓毒症患者的内皮因子水平升高，尽管仅在感染性休克中存在统计学差异。感染性休克和严重脓毒症之间没有观察到差异，表明内皮因子水平升高与脓毒症的炎症反应相关，而不是感染性休克的作用；这与其他炎症介质在严重脓毒症中的增加相似[6]，内皮因子表达和/或脱落水平增加可表明在抵御病原菌入侵时功能的失调及异常定位这样一个事实，如：内皮活化，屏障破坏和吞噬作用等。因此，内皮因子基因缺乏不仅增加细菌感染，同时对内毒素攻击的抗性增加[31]；在宿主反应及感染性休克器官损伤中发挥同样重要作用，体现了内皮因子主要参与者的概念。
BMP-9是TGF-β信号通路的另一个成员，其参与新生血管的生成和稳定[34-36]。编码BMP-9蛋白的GDF2的基因突变也与HHT和肺动脉高压有关 [29]。最近研究表明，BMP-9也参与内毒素介导的白细胞朝血管内皮的募集[37]。尽管这些过程与宿主对脓毒症的反应相关，但是在我们没有发现有关BMP-9蛋白在脓毒症患者中的水平的报道；我们的研究发现，血清BMP-9水平在严重的脓毒症和感染性休克患者中与健康对照间是相似的，因此淡化其作为脓毒症治疗靶点的可能。
HB-EGF最初被认为由巨噬细胞分泌的成纤维细胞和平滑肌细胞的丝裂原[38]。在血管生成中，HB-EGF在周细胞募集和血管稳定中起关键作用[39]，并且由VEGF-A [40]和TNF-α[41]刺激内皮细胞分泌。在我们研究中最有意思的结果之一是，与健康人相比，HB-EGF水平在严重脓毒症和感染性休克患者中几乎降低了50％。据我们所知，这是HB-EGF水平在脓毒症中的首例报道。HB-EGF是通过几种金属蛋白酶对Pro HB-EGF的蛋白水解切割产生[42,43]；并参与了炎性反应和伤口愈合[44-46]。关于HB-EGF在脓毒症发生中的作用，在体外[47]及和体内[45,48,49]的休克和损伤模型研究提示该蛋白质可通过限制细菌易位，保留肠上皮屏障功能。有趣的是，缺乏HB-EGF的小鼠在盲肠结扎和穿刺模型中对脓毒症的抵抗性较低，输注外源性该种蛋白分子则可逆转[46]。有必要进一步研究证实和了解脓毒症期间HB-EGF的相对缺陷，这可能成为这些患者的新治疗靶点。
FGF-2是内皮和血管平滑肌细胞的分裂原，其在血管生成中作用已在体外和体内模型证实[50]。抑制FGF-2可导致内皮屏障功能的严重损伤[51]。虽然FGF-2是首批发现的血管生长因子之一，但我们仅发现两例报告其在脓毒症中循环水平升高的研究报告。而在我们的脓毒症患者中未发现到FGF-2水平的变化。脓毒症患者的严重程度通过在微生物代谢和发病时间方面的异质性来解释这些变化。
我们研究的最主要的缺点在于研究样本的大小限制了我们的结果的普遍性及其描述性质。然而，应该指出的是，这是一项探索性的研究，旨在确定可能代表脓毒症生物标志物和/或发病机制研究的具有有吸引力的新血管生成分子；对实验性脓毒症的继续研究将有助于明确和阐明HB-EGF可能影响脓毒症临床过程的机制。
总之，与健康个体相比，感染性休克与血清内皮因子水平增加及HB-EGF水平降低相关，这些蛋白作为TGF-β和VEGF-A通路的一部分参与血管生成的调控，但仍需要进一步研究来证实我们在特定人群中的结果，并阐明这些发现的病理学相关性。
