阿米士和哈特农村儿童的固有免疫和哮喘风险
苏州市立医院东区ICU 刘军 摘译
Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite
Farm Children
Michelle M. Stein, B.S., Cara L. Hrusch, Ph.D., Justyna Gozdz, B.A., Catherine Igartua, B.S., Vadim Pivniouk, Ph.D., Sean E. Murray, B.S., Julie G. Ledford, Ph.D., Mauricius Marques dos Santos, B.S., Rebecca L. Anderson, M.S., Nervana Metwali, Ph.D., Julia W. Neilson, Ph.D., Raina M. Maier, Ph.D., Jack A. Gilbert, Ph.D., Mark Holbreich, M.D., Peter S. Thorne, Ph.D., Fernando D. Martinez, M.D., Erika von Mutius, M.D., Donata Vercelli, M.D., Carole Ober, Ph.D., and Anne I. Sperling, Ph.D.
N Engl J Med, 2016, 375:411-421
一、研究背景
(一) 环境因素在哮喘和过敏发病中可能发挥重要作用
在过去的半个世纪，西方国家哮喘和过敏发生率明显增加，提示环境因素可能发挥重要作用。近期中部欧洲(中欧)的流行病学研究显示，传统农业有助于保护农村儿童免受哮喘和过敏性疾病，这进一步证实环境暴露在哮喘发生发展中发挥关键作用。然而，传统的农业环境对机体免疫反应的影响仍不清楚。
(二)不同农村作业方式对哮喘发生的影响机制不清楚
美国印第安纳阿米士人和南达科他哈特人均为早期来自欧洲的农村居民，阿米士人从1700s前后自瑞士迁移至美国，阿米士人约1800s自南提洛尔移民至美国。两族人群自移民后仍保持同族内通婚、繁殖后代的相对隔离状态；对于目前已知的多数影响哮喘发生的相关危险因素如儿童疫苗接种率、富于脂肪的饮食、牛奶、儿童肥胖低发生率、母乳孵育的持续时间、极少吸烟、极低空气污染、室内宠物等生活方式相似。然而，阿米士人仍保持传统农业方式，居住在单户奶牛场，以马作为野外工作和交通工具；而南达科他哈特人居住在大型、高度工业化、公有农场。令人惊奇的是，既往研究观察到阿米士人和哈特人学龄儿童哮喘发病率分别为5.2%与21.3%，变应性致敏反应发生率分别为7.2%与33.3%。提示不同农村作业方式对哮喘发生的影响不同，但机制尚不清楚。
二、研究目的
探讨阿米士人和哈特人学龄儿童的免疫功能变化；进而通过小鼠哮喘模型研究环境对气道反应的影响，阐明不同农村作业方式致哮喘发生的免疫学机制。
三、研究方法
(一)研究设计
临床研究：2012年11月，纳入30例7~14岁居住在印第安纳的阿米士儿童；2012年12月，纳入与阿米士儿童性别、年龄等相匹配的居住在南达科塔的哈特儿童。所有患者或获得授权的家属签署知情同意书。
动物实验研究：制备小鼠(C57BL/6野生型小鼠、MyD88基因敲除小鼠、MyD88和Trif基因敲除小鼠)哮喘模型。
检测项目：1.留取全血标本，应用0.1 μg/ml脂多糖(LPS)或0.4μg/ml抗CD3抗体和0.33μg/ml抗CD28抗体，37℃共孵育30小时，随后将上清液和细胞冰冻保存，以备基因表达分析和细胞因子检测。2.流式细胞术检测外周血白细胞和Treg，并检测血IgE水平。3.应用静电灰尘收集器收集房屋空气中的灰尘，1个月后，检测灰尘中内毒素和过敏原水平。将其制备为溶剂，应用于动物实验研究。4.制备小鼠Trif基因敲除小鼠)哮喘模型，每2~3天将50 μl房屋空气中的灰尘提取物滴入鼻子内(总共14次)。
(二)统计学分析
应用R or Prism软件进行统计分析。所有的数据均以（均数±标准差）或中位数 (四分卫间距)来表示。阿米士和哈特儿童细胞因子水平比较应用Wilcoxon signed-rank检验。线性回归分析阿米士和哈特儿童外周血白细胞差异表达基因。流式检测免疫细胞类型应用Student’s t检验。P<0.05被认为有统计学差异。
四、研究结果
(一)两组患儿基线资料和哮喘风险比较
哈特儿童哮喘发病率高，见表1。
表1 两组儿童临床基线资料、哮喘发生率和血IgE水平
(二) 两种农村作业方式空气灰尘内毒素水平
阿米士家庭房屋空气中内毒素水平明显高于哈特家庭，见图1。
图1 两组患儿家庭空气灰尘内毒素水平比
阿米士儿童外周血中性粒细胞比升高，嗜酸性粒细胞减少，单核细胞与哈特儿童类似。阿米士儿童外周血白细胞表达低水平趋化因子受体CXCR4和粘附分子CD11b、CD11c，提示为较幼稚的中性粒细胞。阿米士儿童表达抗原提呈分子HLA-DR低于哈特儿童，而抑制分子ILT3高于哈特儿童，提示阿米士儿童外周血单核细胞处于免疫抑制表型。两组儿童外周血Treg无明显差异。见图2。
图2两组儿童外周血白细胞数量和表型比较
(四) 两组儿童外周血对固有免疫和获得性免疫刺激后细胞因子水平比较
应用固有免疫激活剂(LPS)刺激后，上清液可检测23种细胞因子水平，且阿米士儿童23种细胞因子水平低于哈特儿童。应用获得性免疫刺激剂(抗CD3和抗CD28抗体)，阿米士儿童和哈特儿童上清液中细胞因子水平无明显差异。提示为固有免疫介导。见表2，表3。
表3两组儿童外周血获得性免疫刺激后细胞因子水平比较
(五) 两组儿童外周血基因表达改变
两组儿童外周血基因表达明显改变，见图4。
图 4两组儿童外周血基因表达明显改变
注：蓝色为下调，红色为基因表达上调
(六) 家庭灰尘对哮喘小鼠的影响
灰尘提取物鼻内滴入后，通过固有免疫介导发挥免疫保护效应，且这种效应通过TyD88介导。见图5.
图5家庭灰尘对哮喘小鼠的作用机制
五、讨论
1. 本研究发现，尽管阿米士儿童和哈特儿童有相似的祖先起源和生活方式，但哮喘发生率有明显差异。与哈特人不同，阿米士人采用传统的农村作业方式，暴露于富含微生物的环境中，显示不同的固有免疫特征和极低的哮喘发生率。
2. 本研究显示，外周血白细胞分析显示阿米士和哈特儿童在中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞等固有免疫细胞数量或表型方面存在差异。这可能与持续暴露于微生物环境可能活化固有免疫途径，从而影响免疫效应有关。
3. 应用哮喘小鼠模型观察到，固有免疫途径信号分子MyD88和Trif在灰尘诱发哮喘中发挥重要作用。
4. 本研究也有若干局限性：在单一时间点纳入患者；样本量小；对灰尘在微生物评估手段单一等。
六、结论
阿米士人的居住生活环境可通过调整机体固有免疫反应保护机体免受哮喘。
