受访专家：南京医科大学基础医学院病原生物学系副教授 严沁
2020年1月18日，国家卫健委发文称，新型冠状病毒确诊的标准是：“符合疑似病例标准（同时具备流行病学史和临床表现）基础上，痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等标本行实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。”
2月3日，武汉大学中南医院影像科副主任张笑春发了一条朋友圈：“别迷信核酸检测了，强烈推荐CT影像作为目前 2019-nCoV 肺炎主要依据”，并称这是“一个一线影像医生的大声疾呼！”
关于新型冠状病毒核酸检测试剂盒的质疑也层出不穷：一个典型的案例是，天津一女性感染者，1月21日出现发热后共做了三次核酸检测，结果均呈阴性，2月1日经第四次检测才呈阳性。
究竟什么是病毒核酸检测？为什么可以用核酸检测结果作为新型冠状病毒肺炎的确诊依据？在出现众多假阴性案例后，还能将病毒核酸检测作为确诊方法吗？结果是否仍然可靠？严沁针对核酸检测相关问题进行了解答。
病毒核酸检测是常见的病毒感染检查方法，并不局限于新型冠状病毒。在埃博拉、流感、禽流感等多种病毒性疾病诊断中，都会应用到病毒核酸检测技术，区别就在于所检测的病毒特异性基因不一样。
二、为什么检测病毒核酸可以用于诊断病毒感染性疾病？
这得从病毒的结构说起。病毒是一类结构最简单的微生物，最基本的构成就是核酸和蛋白质。病毒核酸具有特异性，每种病毒各不相同，新型冠状病毒的核酸类型是RNA。
三、如何判断被检测者体内有没有新型冠状病毒？
最直接的方法就是通过分子生物学技术检测出属于新型冠状病毒的RNA，这就像法医找到嫌疑人的DNA一样，是可以帮助我们找到“幕后凶手”的直接证据。目前检测新型冠状病毒核酸的方法主要包括实时荧光RT-PCR（简称为定量PCR）检测和基因测序，而新型冠状病毒核酸检测试剂盒就基于前者，也是最常用的方法。
四、如何应用定量PCR检测新型冠状病毒核酸呢？
病毒核酸是很微量的，因此需要通过PCR(聚合酶链式反应)技术让极其微量的DNA在短时间内成倍增加，而定量PCR是在PCR基础上的“升级版”。简而言之，就是把从患者标本中提取出的核酸从RNA“变成”DNA，再与带有荧光基团的“侦察小分队”作用。这种“侦察小分队”可以敏锐地发现一段属于新型冠状病毒的特异性序列，并发出荧光作为信号，最终被荧光定量PCR仪“捕捉”到。随着PCR过程不断推进，通过监测收集的荧光信号可以判断从样本中取得的初始病毒核酸量，如果核酸含量超过规定的临界值即为阳性结果。每家公司提供的核酸检测试剂盒中的“侦察小分队”不完全一样，但都是基于新型冠状病毒核酸的特异性序列。
基于病毒核酸的检测结果是我们找到“凶手”的最直接证据。2月5日国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》中提到“确诊病例”的判断：“疑似病例具备以下病原学证据之一者为确诊病例：
1、呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；
2、呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。”诊疗方案同时指出，“连续两次呼吸道病原核酸检测阴性（采样时间间隔至少1天）”为解除隔离和出院标准之一。
那么为什么近期有些报道指出，有些新型冠状病毒肺炎患者经过多次检测才被确诊阳性呢？这其中可能有多种原因：
1、每个被感染者体内的病毒量不一，并且在同一个体中病毒量也不是恒定不变的。一般而言，感染早期病毒量较少；随着病毒在体内“繁衍后代”，感染中期会逐渐增多；感染后期，在机体免疫作用和药物治疗下，病毒量又大大降低。因此在病毒量相对少的时期采集样本有可能会出现假阴性。
2、在同一个体的不同部位，病毒量也是不一样的。对于新型冠状病毒而言，存在于鼻咽拭子中的病毒量少于肺部，因此肺泡灌洗液是最佳的采集样本。但从采集难度而言，鼻咽拭子、痰、血液、粪便等是更易获得的常见标本。
3、病毒核酸的检测流程十分复杂，样本采集、储存、运输、核酸提取、检测、结果判读等任何环节的质量控制失误都有可能造成假阴性结果出现。
4、为了快速应对新型冠状病毒疫情，多家公司在短时间内研制出不同的核酸检测试剂盒。不同试剂盒的质量，包括灵敏度、准确性和重复性难免存在差异。
事实上，任何实验方法都是有误差的，即使是实时荧光RT-PCR这样灵敏特异的分子生物学方法也无法保证100%的检出率。
虽然病毒核酸检测会有假阴性，但仍然是病原学诊断的金标准，这是无可替代和毋庸置疑的。但我们同时要重视核酸检测结果误差的问题，可采取以下措施尽量减小误差：
1、除了病原学诊断结果外，综合分析流行病学调查、呼吸道症状、胸部影像学特征、血液检查等结果和临床表现。
2、对疑似病例要多部位采样、多次采样，连续进行核酸检测，有条件的可以用多种试剂盒同时检测，坚持严格排查原则。
3、进一步提高病毒核酸检测试剂盒的质量，积极研发其他辅助检测方法，比如检测病毒抗体的ELISA检测试剂盒或检测病毒蛋白的胶体金免疫检测试剂等。
4、定量PCR法基于病毒基因组中特定核酸序列，因此有必要监测新型冠状病毒基因序列的变异情况，保证检测的特异性和准确性。事实上，研究人员一直在紧密监测病毒的变异情况，目前没有发现病毒变异的证据。
至于文章开始提到的CT检测，在2月4日发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》中将具有”肺炎影像学特征”这一条从”疑似病例”中拆分出来，作为湖北省的“临床诊断病例”，为湖北省新增的一类诊断标准，而在“湖北以外省份”和“湖北省”仍以病毒核酸检测阳性或基因测序与新冠病毒高度同源作为“确诊病例”。
根据这一调整，近期湖北省对既往的疑似病例开展了排查并对诊断结果进行了订正，对新就诊患者按照新的诊断分类进行诊断。为与全国其他省份对外发布的病例诊断分类一致，从2月13日起，湖北省将临床诊断病例数纳入确诊病例数进行公布。
简单来说，从2月13日起，“湖北省”新冠病毒肺炎确诊病例为满足“肺炎影像学特征”、“新冠病毒核酸阳性”、“基因测序与新冠病毒高度同源”三者证据之一，而“湖北以外省份”确诊标准不变，依然是后两者之一。
张笑春之前主张CT检测，是出于排查和防控目的。即主张有接触史者拍CT排查，对于CT阳性人群就近在宾馆酒店等地隔离，不能放任其独自在家隔离。但从方法学角度而言，病毒核酸检测作为病毒性疾病诊断金标准是毋庸置疑的。
八、病毒核酸检测试剂盒储备充足
每个公司研制的新型冠状病毒核酸检测试剂盒的灵敏度和特异性不完全相同。在正常情况下，开发同类检测试剂盒往往需要3-5年，甚至更久。面对这次突如其来的新型冠状病毒疫情时，国家药品监督管理局按照《医疗器械应急审批程序》，简化了部分研发和临床试验流程，应急审批了多家公司研发的新型冠状病毒核酸检测试剂盒。
南京医科大学公共卫生学院流行病学系教授杨蓉西称，特殊情况下，为应对疫情可简化流程符合需要：“质量检和正式临床试验可以暂时不做，但是基本的研发流程，少量的预临床试验，以及标准化生产都是需要的。”
虽然特事特办，但国家药监局还是遵循“统一指挥、早期介入、随到随审、科学审批”的原则，确保产品安全、有效、质量可控。
2月3日，工信部党组成员、总工程师田玉龙在发布会上表示，截至2月1日，各家企业的日均试剂盒产能合计达到77.3万人份，远远超过疑似患者的数量。
在2月4日的央视《新闻1+1》节目中，主持人白岩松提问：武汉目前的核酸试剂检测盒子是否有足够的储备了？国家卫生健康委专家组成员、北京地坛医院感染二科主任医师蒋荣猛回答：目前已经采购到了10万人份的试剂盒。另一个好消息是检测时间从之前的3-4天缩短到当天可以得出监测结果。而且部分医院武汉协和医院等可以自己进行监测，节省了送样和等待监测结果的时间。
来源：南京医科大学
