脓毒症代谢产物的研究：基于感染类型的预后工具
南京大学医学院附属鼓楼医院 董丹江 摘译
Metabolite Profiles in Sepsis: Developing Prognostic Tools Based on the Type of Infection
Sophie Neugebauer, MSc; Evangelos J. Giamarellos-Bourboulis, MD; Aimilia Pelekanou, MD; Androniki Marioli, MD; Fotini Baziaka, MD; Iraklis Tsangaris, MD; Michael Bauer, MD; Michael Kiehntopf, MD
Crit Care Med 2016; 44(9):1649-1662
摘要
目的：目前的生物标志物不能有效鉴别非感染性全身炎性反应综合征（SIRS）与脓毒症，本研究寻找替代的标记物以鉴别SIRS与脓毒症，以及识别潜在的感染类型的目标代谢产物。
设计：回顾性研究
研究人群：希腊脓毒症研究组六个研究点及耶拿大学医院，共纳入406例患者。其中SIRS患者66例，社区获得性肺炎100例，尿路感染112例，腹腔感染83例、血流感染45例。分为试验组（n=268）及确认组（n=138）。
干预措施：液相色谱-串联质谱法测定186种代谢产物。
主要结果：脓毒症患者大多数酰基肉碱、甘油磷脂和鞘脂的血清浓度较SIRS患者有显著的改变。回归分析模型显示联合鞘脂SM C22:3与甘油磷脂lysoPCaC24:0诊断脓毒症的敏感性为84.1%，特异性为85.7%。此外，特定的代谢产物可用于识别潜在的感染类型。甘油磷脂lysoPCaC26:1可识别脓毒症的CAP患者。在严重脓毒症/脓毒性休克，可通过乙酰鸟氨酸降低来识别血流感染患者。根据潜在感染类型，在脓毒症与严重脓毒症/脓毒性休克之间也可以出现不同代谢产物变化，腐胺、lysoPCaC18:0、SM C16:1分别与CAP、腹腔感染、血流感染的不良预后相关。
结论：用代谢组学的方法，确定代谢产物对脓毒症具有良好的诊断价值，虽也有14%的假阳性率。此外，代谢产物也可用于鉴别潜在的感染类型及判断预后。但有必要进行进一步的研究来证实其可作为脓毒症的新型诊断工具。
关键词：诊断；代谢产物；预后；脓毒症；全身炎症反应
一、 研究背景
严重脓毒症及脓毒性休克仍然是导致死亡的主要原因。众所周知，早期管理是降低脓毒症病死率的关键，然而脓毒症当前基于生物标记物和常规微生物检测的诊断技术既不快速也不可靠。
传统意义上，脓毒症的生物标记物是炎症反应过程中所产生的分子物质，其浓度水平可以反映炎症的严重程度。虽然一些实验室参数，如C-反应蛋白（CRP），白介素（IL）-6和降钙素原，目前已在临床实践中广泛使用，但均不能完全鉴别感染性与非感染性炎症反应。例如，降钙素原升高也可以见于某些非感染性的状态（严重创伤和外科手术）。这些生物标志物的局限性很大程度与脓毒症患者高度的个性化特征相关。最近一个来自希腊脓毒症研究小组（HSSG）505例患者的研究中用流式细胞仪分析其免疫状态，研究表明在脓毒症向严重脓毒症/脓毒性休克的进展过程中，宿主免疫状态的差异取决于潜在的感染类型。由此推测，迄今为止大多数正在研究的生物标记物可能也有类似的改变。
基于高通量技术的方法学支持个体化的概念，如转录组学、蛋白质组学和代谢组学等。在最近的一项针对性研究中，143例ICU危重患者血浆中确定了186种代谢产物，分析表明，其中两种代谢（酰基肉碱C10:1和甘油磷脂PCaaC32:0）能够鉴别全身炎症反应综合征（SIRS）和严重脓毒症。虽然这项研究显示了两种代谢产物在诊断方面的有效性，由于研究人群为术后的腹腔脓毒症患者，与门诊或普通病房进展的其他脓毒症存在差异，故研究有其局限性。为了明确代谢产物对早期脓毒症的诊断价值，我们进行了大样本研究。
二、 研究目的
本研究旨在明确代谢产物在鉴别非感染性SIRS与脓毒症、识别潜在感染原因中的作用，以及确定标记物对判断预后的价值。
三、 研究方法
（一） 研究设计
本研究为回顾性研究。对2007年1月至2012年1月希腊脓毒症研究小组（HSSG）六个试验点，以及2002年9月到2003年9月耶拿大学医院ICU的采集样本进行分析。研究通过伦理委员会批准，患者本人或获得授权的家属签署书面知情同意书。
（二） 受试人群
纳入标准：1）年龄大于18岁；2）过去的24h出现SIRS征象；3）急性胰腺炎、严重创伤（损伤严重指数>10分）、冠状动脉搭桥手术后临床及影像无感染证据、社区获得性肺炎（CAP）、腹腔感染（IAI）、尿路感染（UTI）或原发性革兰氏阴性杆菌血流感染（BSI）。
排除标准：1）粒细胞减少（中性粒细胞<1000/uL）；2）HIV感染；3）长期服用糖皮质激素治疗（大于相当于强的松1mg/kg/d的剂量、超过1个月以上）。
急性胰腺炎定义：1）上腹部疼痛伴腰背部放射痛；2）血清淀粉酶高于正常值的三倍以上；3）尿淀粉酶高于正常值三倍以上；4）CT或超声存在急性胰腺炎的影像学表现；5）无原发性肝脏疾病。SIRS和脓毒症分层诊断参照国际定义。
上腹痛12小时内或因脓毒症转入ICU24小时内，无菌条件下采集前臂静脉血10ml，收集在干燥试管内，离心分离后血清于–80°C储存。
CAP诊断依据：1）过去的90天内与医疗设施无接触史；2）胸部X线新出现的肺实变阴影；3）出现呼吸困难、肺部啰音、脓性痰中2个或2个以上症状或体征。BSI为血液中分离到病原菌。如分离到凝固酶阴性的葡萄球菌或皮肤定值菌则被认为是污染。IAI是存在SIRS并伴有影像学检查（超声或CT）证实的感染灶。尿路感染诊断依据为排尿困难、脓尿（>10个白细胞/高倍视野尿），并结合超声检查阳性结果。
（三） 观察指标
标记物测定方法：使用免疫法测定CRP，免疫荧光法测定降钙素原，化学发光免疫分析法测定IL-6。六种代谢产物浓度（酰基肉碱、氨基酸、生物胺，甘油磷脂，鞘脂和糖）的测定分别参照制造商协议以及既往研究。
（四）统计学分析
使用SPSS 19分析软件进行统计学分析。每个研究点的每三例入选患者按照2:1的独立随机原则分为试验组及确认组。基线特征的比较采用配对t检验。代谢产物和传统生物标志物正态分布检测后，无论是配对t检验还是曼-惠特尼U检验，使用Bonferroni调整进行事后多重比较以避免随机偏差。规范化采集数据（采用中位数+标准差形式）。使用卡方自动交互信息检测算法创建决策树。对于组合的分析物采用Logistic回归分析。代谢物质的敏感性、特异性以及对分类正确的预测采用ROC曲线绘制，所有数据（包括异常值）均包含在曲线上，鉴别感染与SIRS、识别潜在感染类型、预测严重后果的最佳临界浓度可通过ROC曲线的约登指数最大值（敏感性+特异性-1）计算出。根据对数秩检验作出Kaplan-Meier生存曲线。
四、 研究结果
（一） 受试人群
共纳入406例患者，其中试验组268例，确认组138例（见图1）。两组疾病类型见表1。两组间人群特征及疾病严重度无显著差异。
图1 研究流程图
表1 潜在感染类型及研究分组的人口及临床特征
（二） 脓毒症相关代谢产物
本研究的主要终点是明确代谢产物是否能鉴别SIRS与脓毒症。SIRS组为了反映非感染性患者炎症反应的异质性，设计了三组SIRS人群：急性胰腺炎、创伤后SIRS及心脏手术后SIRS。这三组人群之间的代谢产物有显著差异（补充表1）。急性胰腺炎所有代谢产物类型中大多数较创伤、术后SIRS患者有显著升高，但也有一些是降低的。另外，心脏手术后SIRS的代谢产物也显示较创伤后SIRS有升高或降低。提示不同的病因下SIRS存在异质性，也不能排除由于试验点条件不同而导致的偏差。
我们最近发表的一项研究中，在74例严重SIRS和严重脓毒症患者发现两种代谢产物（PCaaC32:0和C10:1）能有效的鉴别SIRS与严重脓毒症（敏感性73.3%，特异性84.8%），Logistic回归分析显示，联合两者识别严重SIRS和脓毒症的敏感性为89.2%，特异性为73.5%，但识别普通SIRS及脓毒症患者的敏感性及特异性下降。因此我们检测了其他代谢产物的鉴别能力。
比较了所有非感染性SIRS与脓毒症患者，在试验组发现脓毒症患者中有11种产物升高，15种产物降低（见图2A），其中包括3种酰基肉碱、3种氨基酸、5种生物胺，8种甘油磷脂，7种鞘脂，其热敏图显示（见图2D）。选择鞘磷脂SM c22:3、甘油磷脂lysoPCaC24:0进行Logistic回归分析，结果显示联合两者（AUC 0.9 [95% CI, 0.839–0.962], cutoff 0.983），相比较传统标记物预测脓毒症的准确性更高，CRP（AUC 0.743 [95% CI, 0.658–0.827]; p=0.000131）、降钙素原（AUC 0.615 [95% CI, 0.506–0.724]; p<0.000001）、IL-6（AUC 0.578 [95% CI, 0.454–0.702]; p<0.000001）（见图2B、2C）。联合两者诊断脓毒症的敏感性为84.1%，特异性为85.7%。
图2 SIRS及脓毒症代谢产物可视化改变
（三） 代谢产物与潜在感染类型的关系
本研究的次要终点为代谢产物与潜在感染类型的相关性。不同的感染之间存在较大异质性。将代谢物绘制成热图以形象化表明它们在脓毒症中的变化（见图3，3A左侧为脓毒症热图，3B左侧为严重脓毒症/脓毒性休克热图）。
脓毒症患者中，CAP出现代谢物的变化相比较其他感染类型更显著，而IAIs、UTIs、BSIs之间则无显著差异。甘油磷脂lysoPCaC26:1对识别CAP的敏感性及特异性最好（AUC 0.818 [95% CI, 0.687–0.948]，敏感性76.9%，特异性98.9%，阳性预测值95.2%，阴性预测值94.1%）（见图3A右侧）。严重脓毒症/脓毒性休克患者中，相比较IAIs、UTIs、BSIs，CAP也出现了显著的代谢物变化。甘油磷脂lysoPCaC26:1同样对识别CAP的敏感性及特异性最好（AUC 0.851 [95% CI, 0.751–0.950]，敏感性82.0%，特异性98.4%，阳性预测值957.1%，阴性预测值89.7%）（见图3B右侧）。
严重脓毒症/脓毒性休克患者中的IAIs、UTIs、BSIs之间的代谢物变化也不同。我们观察到UTI与IAI比较，甘油磷脂水平增高。UTI与BSI比较，酰基肉碱C18:1、甘油磷脂、生物胺、鞘脂水平增高。IAI与BSI比较，酰基肉碱C2和生物胺乙酰鸟氨酸水平升高。其中生物胺乙酰鸟氨酸排除严重BSIs的可能性较大（AUC 0.853 [95% CI, 0.757–0.948]，cutoff 0.697 μM，敏感性93.8%，特异性71.7%，阳性预测值53.6%，阴性预测值97.1%）。
图3 不同潜在感染类型的脓毒症代谢产物的可视化改变
（四） 预后标记物
基于之前HSSG的研究发现，脓毒症与严重脓毒症/脓毒性休克之间先天免疫及适应性免疫应答的差异取决于潜在的感染类型，我们比较了每种感染类型脓毒症与严重脓毒症/脓毒性休克分别的代谢组学。分析显示，不同的感染类型之间存在较大的异质性（见图4A）。这促使选择一种代谢产物作为不同感染类型的预后指标。我们选择最低p值的代谢产物作为脓毒症与严重脓毒症之间预后有显著性差异的预后指标，CAP为生物胺腐胺，IAI为甘油磷脂lysoPCaC18:0，BSI为鞘脂SM C16:1（见图4B），无显著性的代谢产物可识别UTIs脓毒症的严重程度。Kaplan-Meier分析显示，CAP中腐胺的临界值浓度为>0.072 μΜ，提示与不良预后相关（AUC 0.774 [95% CI, 0.657–0.892]）；IAIs中lysoPCaC18:0的临界浓度为<12.23 μM（AUC 0.858 [95% CI, 0.755–0.961]），BSI重SM C16:1的临界浓度为<17.57 μM（AUC 0.975 [95% CI, 0.920–1.000]）（见图4C-E）。
图4 疾病个体化代谢产物作为不良预后的早期预测标记物
（五） 确认组分析结果
确认组138例患者独立测试两个方面：1.联合SM C22:3 and lysoPCaC24:0两个指标是否能鉴别SIRS与脓毒症；2.已查明的代谢产物是否可识别潜在感染类型以及提示不良预后。结果表明，研究终点基本被证实（见表2）。在确认组联合SM C22:3 and lysoPCaC24:0两个指标鉴别SIRS与脓毒症的敏感性与特异性分别为85.1%、87.5%。
表2 研究终点的确认
五、 讨论
人类代谢组学是一项持续变更的课题。本研究表明联合两组代谢物质（SM C22:3 and lysoPCaC24:0）可鉴别脓毒症与SIRS，测试组和确认组的敏感性分别为84.1%/85.1%，特异性分别为85.7%/87.5%。同时研究也表明，代谢物质可作为判断不同潜在感染类型以及预后的生物标记物。
既往研究中的生物标记物鉴别由感染导致的脓毒症和其他原因导致的炎症反应的敏感性及特异性不高，尤其不能鉴别SIRS与不复杂的脓毒症（如未合并器官功能障碍）。我们的研究中，联合SM C22:3 and lysoPCaC24:0可以鉴别SIRS与不太严重的脓毒症。脓毒症中，大部分代谢产物的表达均有下调，尤其是酰基肉碱、甘油磷脂和鞘脂类。一些人类研究已揭示了脓毒症过程中的脂代谢变化，发现脂蛋白水平降低，特别是高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）及磷脂，而游离胆固醇及甘油三酯水平增高（故称之为高脂血症脓毒症）。同时脂蛋白的构成及功能也发生改变，例如HDL中淀粉样蛋白A（SAA）快速增高，且分泌非胰腺磷脂酶A2（sPLA2）。SAA作为一种脂多糖（LPS）似乎参与了与LPS结合蛋白结合，以及增加了巨噬细胞介导的LPS摄取的过程，这也是假设的HDL水平下降的机制。已证实富含SAA的HDL可激活sPLA2，其释放的氧化脂肪酸可导致促炎反应及动脉粥样硬化。而氧化脂类似乎对脓毒症有保护作用。酰基肉毒碱水平也有显著改变，这与我们之前的一项69例严重脓毒症/脓毒性休克患者，以及最近一项大型的全身代谢产物对脓毒症死亡预测作用的研究相符合，提示了线粒体功能受损这一脓毒症普遍存在的特征部分是由于组织低灌注所导致。
我们的研究首次表明了代谢产物与潜在的感染类型之间的相关性。相比起CAP，IAI、UTI和BSI较少地引起代谢物的广泛变化。CAP病原菌主要为肺炎链球菌，与革兰氏阴性杆菌相比具有完全不同的毒性特征。在一项肺炎链球菌感染的小鼠模型代谢产物的研究中，结果显示无论是哪种血清型肺炎链球菌肺炎，甘油磷脂和腐胺在肝脏和肺有不同的表达。此外，我们的研究还表明腐胺与CAP的不良预后相关，这与最近Shah等的研究中腐胺是肺炎链球菌生长、适应度、毒性的重要代谢产物的观点相一致。
革兰氏阴性杆菌是IAI、UTI和BSI的主要病原菌。在大鼠铜绿假单胞菌腹膜炎的模型中，肝脏脂质过氧化上调，而肾脏脂质过氧化下调。过度脂质过氧化是由于自由基过度释放，并导致随后的线粒体电子链损害。这导致肝脏中鞘脂、甘油类生物合成下降，可以解释在严重IAIs、BSIs中的发现。
本研究中观察到严重BSI患者鞘脂和磷脂酰胆碱水平显著下降。BSI进展过程中，循环中内毒素水平增加，与之有关的脂蛋白相关磷脂酶A2 （Lp-PLA2）的水平也增加，快速水解磷脂酰胆碱为溶血磷脂。此外，LPS可增加分泌性磷脂酶的活性，水解鞘磷脂生成神经酰胺，导致血清鞘脂的减少（35）。这可以解释BSI引起的严重脓毒症/脓毒性休克中所观察到的代谢产物变化。
CAP相比其他类型的脓毒症患者出现显著的代谢产物的变化，猜测可能与肺的上皮细胞较其他器官更多，以及气道上皮细胞特殊的脂质成分有关，当出现肺部感染性疾病时导致不同的改变。
本研究的局限性：1. SIRS组及亚组的样本量较小，可能影响ROC曲线的准确性。2. 样本质量及脓毒症标记物的鉴定，受各个研究点条件，如取样、运送、离心时间、冻结时间、以及样品储存的影响，从而影响代谢物的检测，例如临界浓度等。因此有必要在大型的前瞻性研究中重新评估临界浓度。已考虑到预实验的差异很多是由于研究组在各个研究点分布不均导致，本研究HSSG是在类似的条件下收集CAP、IAI、UTI、以及BSI样本资料，并且每个试验点的样本不能集中进行七种主要代谢产物的研究。但是胰腺炎患者和创伤/心脏术后SIRS患者是分别来自HSSC和耶拿医院，因此不能安全排除两者代谢产物之间的偏差。4. 不能排除有其他因素，例如治疗、支持措施的差异带来的影响。
六、 研究结论
SIRS与脓毒症、CAP与其他感染类型、以及脓毒症与严重脓毒症/脓毒性休克之间的代谢组学存在差异，可能成为脓毒症早期诊断以及判断预后的工具。需要更大规模的前瞻性研究以确认在脓毒症管理中这些代谢产物作为生物标志物的有效性。
原文见附件：upfile/File/201611/02/06530296.pdf
