血浆细胞因子水平预测感染性休克患者对激素治疗的反应性
淮安市第一人民医院 章向成 摘译
Plasma cytokine levels predict response to corticosteroids in septic shock
Peter Bentzer1,2,3,4*, Chris Fjell1,2, Keith R. Walley1,2, John Boyd1,2and James A. Russell1,2
Intensive Care Med，2016， Apr 12，DOI:10.1007
摘要
目的：探讨血浆细胞因子水平是否可以预测感染性休克患者对激素治疗具有反应性。
方法：研究纳入了一组感染性休克患者（n=363），检测他们血浆中39种细胞因子的基础水平。采用倾向匹配得分方法对接受糖皮质激素治疗与未接受糖皮质激素治疗的患者进行分组。在接受糖皮质激素治疗与未接受糖皮质激素治疗的患者中，每种细胞因子的最佳阈值为浓度超过28天生存期的最大OR值。
结果：采用倾向得分匹配方法将165位患者分成61组，每组均包括匹配的激素治疗患者和非激素治疗患者。其中13种细胞因子浓度阈值的生存OR值在接受糖皮质激素治疗与未接受糖皮质激素治疗患者中具有统计学意义（P<0.05）。CD40最大OR值可区分21%在倾向得分匹配患者中对糖皮质激素治疗的反应性。三种细胞因子组合可区分更高比例的治疗反应性。IL3，IL6和CCL4可区分50%在倾向得分匹配患者中对糖皮质激素治疗的反应性。28天生存期OR值为19（95%CI 3.5-140，P=0.02），其中至少一种细胞因子的浓度高于阈值。
结论：血浆内某些特定的细胞因子的浓度可以作为潜在的生物学标记来区分哪些感染性休克患者可从糖皮质激素治疗中获益。
关键词：皮质类固醇，预测性生物标记，细胞因子，倾向评分匹配，感染性休克
一、研究背景
激素治疗用于调节脓毒症患者急性炎症反应已多年，但存在争议。感染性休克是致病菌和宿主相互作用导致的内环境失衡状态，所以尝试区分出对于激素治疗有利的亚组感染性休克病人。尽管感染性休克患者血浆内皮质醇浓度是增高的，但是在一些患者中这种应答被认为是不充分的。基于这样的理论提出，促肾上腺皮质激素刺激实验可以筛选出肾上腺分泌不充分的亚组患者，这类患者应用皮质醇替代治疗可能有效。然而，后续的实验并没有证实这个结果，并且目前感染性休克的治疗指南并不提倡应用促肾上腺激素实验区分患者是否能从激素治疗中获益。
因此，确定是否存在亚组病人的确适用激素治疗，显得很有必要。我们由于以下原因采取了不同的方法去评估细胞因子。研究表明增加了的促炎及抗炎因子与感染性休克的不良转归有关。并且细胞因子的表达水平是一个不依赖于临床状态，对临床转归有很好的预测作用的因子，这表明了细胞因子水平提供的信息并不是容易被临床所应用的。基于以上研究，我们提出假设，感染性休克中，细胞因子可以在早期作为预测性生物标记来判断机体对激素治疗的应答反应。我们从VASSST随机选取患者，随机对照试验，分别使用抗利尿激素和去甲肾上腺激素，并且我们检测了患者的细胞因子、趋化因子和生长因子。在VASST中，激素治疗不是随机的、双盲的或者有计划的。因此，我们采用倾向性评分匹配使用激素治疗和未使用激素治疗的患者。然后我们分析激素治疗和39种细胞因子对28天死亡率的影响。
二、研究目的
本研究目的是探讨细胞因子可以在感染性休克早期作为预测性生物标记物来判断机体对激素治疗的应答反应。
三、研究方法
(一)、受试对象
VASST是一项对使用血管加压素或去甲肾上腺素的感染性休克患者的多中心随机对照试验。伦理委员会参与机构批准了这项研究。患者、家属或代理人签署同意了参加本项研究。感染性休克的定义为出现两种或以上的全身炎症反应综合征（SIRS）症状、证实存在或怀疑有感染、出现至少一个新的器官功能紊乱、尽管采用液体复苏以及至少5μg/min的去甲肾上腺素（或其他等价替代药物）维持6h仍然存在的低血压。排除标准：不稳定性冠脉综合征、急性肠系膜出血和严重的慢性心脏疾病。激素治疗是随机的，并且其用药时间长短和剂量都是患者主治医师决定的。
(二)、血浆细胞因子的检测
从VASST随机对照试验中获得的363位患者的基础血浆样本在首次开始用药的2小时内采集。69位长期使用激素治疗的患者被除外，其余的294位患者用于倾向性评分匹配。从到医院到纳入研究的平均时间为12h。血浆存放于-80℃，并且已经采用两次冻融循环处理过。39中细胞因子被检测。包括（现用名和曾用名），CCL11（嗜酸性粒细胞趋化因子）、CCL2(MCP1)、CCL22 (MDC)、CCL3 (MIP1a)、 CCL4 (MIP1B)、CCL7(MCP3)、CD40LG、CSF2 (GMCSF)、CSF3(GCSF)、CX3CL1 (fractalkine)、CXCL1 (GRO)、CXCL10(IP10), EGF (EGF)、FGF2 (FGF2)、FLT3LG (Flt3L)、IFNA2(IFNa2)、IFNG (IFNG)、IL10 (IL10)、IL12B (IL12B)、IL12P70 (IL12P70)、IL13 (IL13)、IL15 (IL15)、IL17A(IL17)、IL1A (IL1a)、IL1B (IL1B)、IL1RN (IL1RA)、IL2(IL2)、IL2RA (IL2RA)、IL3 (IL3)、IL4 (IL4)、IL5 (IL5)、IL6(IL6)、IL7 (IL7)、IL8 (IL8)、IL9 (IL9)、LTA (TNF-β)、TGFA(TGFα)、TNF (TNF-α)和VEGFA (VEGF)。有些样本的细胞因子浓度报告低于或高于校准范围，则采用其相应的范围的最低值或最高值代替。20%的细胞因子浓度低于其测量范围的最低值，0.4%的细胞因子浓度高于其测量范围的最高值。
(三)、倾向性评分匹配
激素治疗患者和非激素治疗患者采用倾向性评分去匹配不同的影响转归的各种基本变量。倾向性评分采用线性回归分析计算，包括以下基本特性：年龄、性别、APACHE II（慢性健康状况评分）、糖尿病、肝功能、缺血性心肌病、充血性心力衰竭、肺部疾病（包括慢阻肺）、慢性肾衰（透析）、基础的去甲肾上腺素用量、免疫抑制（化疗、放疗、白血病、淋巴瘤、艾滋病）、感染源、病原体、抗利尿激素治疗和手术史。保留最大的样本量的同时，平衡基本变量，对于用药和非用药患者的数量没有限制。这意味着一个用药患者可以匹配一个甚至几个非用药患者，反之亦然，只要他们倾向性评分匹配。所以组成的匹配组数由（1）倾向性评分的测量宽度和（2）这个测量宽度内的激素治疗患者和非激素治疗患者是否可以匹配所决定的。测量宽度被定为倾向性评分的上下0.2个标准差。加权的标准化的差异的应用可以避免样本量大小对结果的影响。标准化的差异小于10%被认为是微不足道的差异，这意味着，不同组别和测量宽度之间的协变量下调至0.0125。
(四)、计算激素治疗有益的细胞因子最佳阈值
用于预测激素治疗疗效的细胞因子的最佳阈值是由反复的回归分析得出的，最高的28天生存率决定了细胞因子的阈浓度。
(五)、结果计算方法
主要终点是28天生存率。不同的生存结果采用logic回归分析。生存曲线采用Cox比例风险模式表达。次要终点是在院的第一个28天内，解除机械通气(DAF vent)、解除升压药治疗(DAF pressor)、解除透析治疗(DAF renal)的天数。任何在观察的28天内去世的患者，被规定为存活0天并且没有任何的器官支持治疗。
四、研究结果
(一)、患者资料及倾向性评分匹配
图.1中显示的是患者数的统计图表。治疗组间存在显著统计学差异的APACHE II评分、免疫抑制和几个实验室检查优先匹配（表.1）。根据倾向性评分匹配，61组匹配的病人每组包含至少一个激素治疗患者和至少一个非激素治疗患者。一个组从2个人至8个人不等，总共165个患者（100个激素治疗者和65个非激素治疗者）。匹配后只有动脉血PH存在统计学差异。非激素治疗比上激素治疗者的中数比是1:1（IQR（四分位间距） 1:1-1:2）（范围 2:1-1:7）。匹配后，除了4个基本变量（体温、动脉血PH值、新的神经功能缺损、新的血液的缺损）的标准化差异是大于10%，其余的均是小于10%（表.1）。95%的患者应用的是氢化可的松。在激素治疗组的每日氢化可的松用量的中位数是250mg（IQR 100-305），其用药时间中位数是7天（IQR 4-14）。无论是在匹配前还是匹配后，激素治疗组和非激素治疗组的28天生存率之间无差异（表.1）。在匹配是被除外的患者资料在补充的表1中。
图1 研究患者纳入流程图
表1 患者在倾向性匹配前后特征
(二)、细胞因子的水平预测了激素治疗的价值
根据激素治疗组和非激素治疗组的28天生存率比值比存在统计学差异（P<0.05），推断出13种细胞因子可以预测出激素治疗有益的疗效。表2中给出了最高比值比（OR）时的细胞因子血浆浓度和P<0.05时的有效OR值范围内的细胞因子浓度。对激素治疗有应答反应的患者比例从CD40LG对应的21%到IL15对应的67%。最高的28天生存率比值比对应的是CD40LG。CD40LG最佳的阈浓度和相应的比值比都呈现在图2中。
表2 血浆细胞因子浓度预测激素治疗对28天病死率有益效应
图2 血浆CD40LG水平测定预测激素治疗后28天存活优势比
为了探究是否组合细胞因子的水平可以识别更高比例对激素治疗有效的患者，我们组合具有统计学差异的OR值的两个或三个细胞因子，采用有它们的最佳阈浓度进行分析。最合适的细胞因子的组合是根据这两个或三个细胞因子是否有最高的OR值决定的。具有最高的OR值的一对细胞因子是IL3和IL6，超过至少其中一个阈浓度的患者有71个，并且激素治疗患者和非激素治疗患者的OR值是47（95% CI 5.8–653, P =0.035）。
三个有最高的OR值的细胞因子的组合是IL3、IL6和CCL4，超过至少其中一个阈浓度的患者有82个，并且激素治疗患者和非激素治疗患者的OR值是19（95 % CI 3.5–140, P = 0.02）。图3给出了一个Kaplan-Meyer曲线，它包含了任何浓度高于三联组合的LI3、LI6和CCL4阈浓度的匹配了的激素治疗或非激素治疗患者，也包含了低于上述三联组合阈浓度的激素治疗和非激素治疗患者。Cox比例风险分析提示，这些阈浓度预测了细胞因子浓度高于任何一个阈浓度的患者是可以从激素治疗获益的（P =0.01，阈浓度高于三联组合的激素疗效）。在入院的第一个28天内，高于三联阈浓度的患者从入院到死亡的时间分别是，激素治疗组10天（IQR 3–23, n =13），非激素治疗组6天(IQR 5–10, n=14) (P=0.37)。在细胞因子浓度全部低于三联阈浓度的患者中，激素治疗是有害的[P<0.01, OR survival 0.02 (95% CI 0.001–0.13)]。无论在高于还是在低于阈浓度的患者中，APACHE II评分和既往史是相似的。然而生理和实验室指标却有显著的差异（补充的表2）。我们同样得检测了除了长期使用激素治疗的其他全部患者（n=294，见图1），我们发现三联细胞因子阈浓度同样可以预测他们对激素治疗的应答反应(P=0.03)。为了评估低于或高于正常测量范围的细胞因子浓度的重要性（见方法），我们重新匹配了只包含正常测量范围内的三联细胞因子的患者。结果，117个患者仍包含在38组队，对他们进行了分析。我们发现细胞因子对激素治疗的疗效评估不再有统计学差异，但是趋势较之前的数据相同[OR 3.5 (95% CI 0.5–26.7, P =0.20)]。
图3 各组(激素治疗或未治疗及CCL4、IL3、IL6阈值之上或下)生存曲线比较
(三)、是否只在抗利尿激素治疗的患者中才存在激素治疗有效
在感染性休克患者中抗利尿激素和皮质醇的相互协同作用早已报道过。我们尝试去分析不接受抗利尿激素治疗的患者中，高于三联细胞因子阈浓度患者中激素治疗的疗效。为了保证数据的说服力，我们没有限制测量宽度重新匹配了患者。最后，120个患者匹配成了30组队的数据。在没有接受抗利尿激素的组别中，从28天生存率OR值没有看到激素治疗的效果[OR 0.4 (95% CI 0.02–7, P =0.68)]。相似的分析结果显示，匹配的仅包含高于三联细胞因子阈浓度的抗利尿激素治疗的患者，从28天生存率比值比可以看出，激素治疗有效[OR 14 [95% CI 2–162, P =0.016)]。
(四)、激素治疗在次要终点中的作用和24h内细胞因子的浓度
对于超过三联因子阈浓度的患者的器官支持治疗结果与死亡率结果有相同的趋势，但是没有统计学差异。非激素治疗患者不需要辅助通气的时间的中位数是5天(IQR 0–18)，而激素治疗患者其中位数是14天(IQR 0–23) (P =0.19)。非激素治疗患者不需要透析的时间的中位数是0天(IQR 0–7)，而激素治疗患者其中位数是2.5天(IQR 0–20) (P =0.32)。非激素治疗患者不需要血管加压药支持治疗的时间的中位数是20天(IQR 0–23)，而激素治疗患者其中位数是23天(IQR 0–25) (P =0.15)。相关数据呈现在补充的表3,4中。
我们用了以下方法验证激素治疗是通过调节细胞因子浓度发挥效果的，24h内应用了激素且高于三联因子阈浓度的病人，其从入院时的基础浓度到24h时的浓度变化与高于三联因子阈浓度却没有激素治疗的病人相比。结果表明，无论是否激素治疗，从基线到24h时，细胞因子的浓度普遍都是下降的，CCL11, CXL10, IL2, IL1RN, 和CCL22在激素治疗组下降的比非激素治疗组明显（补充的表格5）。
五、讨论
利用39种细胞因子浓度分析出来的激素治疗效果，我们发现有13种细胞因子可以识别出通过激素治疗可增加28天生存率的部分病人。我们进一步得出结论，三联细胞因子（IL3, IL6, 和CCL4）可以鉴别出对激素治疗存在有益应答的患者。最后，在这些患者中，在最初的24h内，激素治疗使得某些细胞因子显著下降。
IL3和IL6联合可以识别出更多的对激素治疗有效的患者，比单独一个细胞因子识别的多，再加上一个CCL4，又增加了另外11个人。这些结果表明，激素治疗效果越好，作为对激素治疗效果评估的生物标记物，细胞因子水平的敏感度越高。总所周知，IL6对先天性的和获得性的免疫功能都很重要，并且它既是促炎因子又是抗炎因子。IL3可以促进骨髓细胞生成，最近研究表明它对感染性休克时炎症的级联放大反应至关重要。CCL4在炎症反应中，对调节性T细胞的募集有重要作用。既往研究认为，这三个细胞因子均预测了感染性休克的不良转归。
我们采用最高OR值时的细胞因子浓度为合适的阈值，可能会被质疑过于保守，并且采用具有统计学差异的OR值时最低的细胞因子浓度，可以增加其敏感度（图2中最左边的两条垂直的蓝线可以证实）。然而我们选择前者的原因是，它是受到样本量大小影响最小的。同样有人认为IL15可以作为单独的预测因子，因为它可以识别最多的患者数量，虽然治疗效果欠佳（表2）。
两个近期的大样本量研究采用了倾向性评分匹配证实，激素治疗并不能改善患者的死亡率。与这些研究相同，我们的研究结果显示，在匹配的患者中，激素治疗不能增加28天生存率，并且我们的研究支持了只有特定的患者才能从激素治疗中获益的观点。上面提及的一篇文献中表明，APACHE II>30的具有严重疾病的患者激素治疗后可以降低28天死亡率。我们的研究中，低于或高于三联因子阈浓度的患者之间的APACHE II评分没有显著差异，然而我们的研究中，高于阈浓度的患者中的某些实验室检查指标更差，这个说明，可能疾病严重程度越重，对激素的应答反应越强（补充的表2）。基于上述的结果，我们得出结论，是否细胞因子浓度仅仅反应了疾病的严重程度或者增加了一个独立的预测性临床参数。在我们的研究中，组与组之间的实验室差异很小。这说明，在临床上很难根据疾病研严重程度去识别激素治疗有效的患者，而细胞因子增加了预测的价值。
我们的研究发现，氢化可的松在最初的24h里降低了细胞因子的浓度，这与下面的假设相呼应：激素治疗降低死亡率可能是通过调节过度激活的炎症反应实现的。这与我们之前的研究结论相一致：存活的感染性休克患者较非存活者有较低的细胞因子水平。然而，我们的研究不能给出调节激素治疗效果的机制。此外，我们没有排除掉高于或者低于测量范围的细胞因子浓度的数据可能细胞因子浓度的真实变化被低估了。值得一提的是，激素治疗组有些细胞因子最初的24h内下降的较非激素治疗组少。是否这个趋势反映了激素治疗的真实生物功能，没有统计学差异只是因为样本量小。还是只是一种巧合而已。
存在争议的是，排除在外的129个患者大多数是激素治疗的患者，这个是否对我们的实验结果产生偏倚。然而，在整个患者中，我们的三联细胞因子仍然预测了激素治疗的疗效，这点说明我们的三联细胞因子是稳定的预测性生物标记。我们的研究同样暗示了激素治疗对于细胞因子浓度低于阈值的患者是有害的。这点进一步支持了激素治疗仅对特定的感染性休克患者有效的观点。我们的研究不能证明对于未使用抗利尿激素的患者，其皮质醇治疗是有效的。这说明，具有高细胞因子浓度的患者，其激素（皮质醇）的治疗效果是依赖于联合应用抗利尿激素的。或者，可能是由于分析或匹配的不完善造成的。
我们包含了所有的细胞因子测量值，包括低于或高于测量范围数据，这是因为，这样更好的模拟了临床的状况，临床患者中，有些病人的细胞因子水平正是超出测量范围的。至于只对在正常测量范围内的三联细胞因子进行分析时，并未得出激素治疗有效的结论，可能的原因如下。第一，只有高出阈浓度的患者纳入计算OR值。排除了细胞因子最高的患者（高于测量范围上线），这类患者可能是激素治疗最有效的患者，然而恰恰被排除了。第二，可能是样本量缩小了造成的。
这个实验的下一个步骤是，观察这些不同细胞因子的阈值在更大的样本量中的结果。如果结论进一步被证实，那我们可以提出，三联细胞因子可以用于以后的随机配对试验中，去识别对激素治疗有效的感染性休克患者，还可以用来观察激素治疗的效果。
我们研究不足与优势。 其中一个不足是，我们的激素应用不是随机的、双盲的或有计划的。此外，我们不能排除可能部分患者在测量基础细胞因子水平前已经使用过激素。最后，我们的样本量较小，故结论要谨慎解读。
我们的优势是我们很好的匹配了激素治疗患者和非激素治疗患者，并且激素治疗与否是考虑了个体患者的具体情况而定的。我们还包含了大数量的细胞因子，包括了39种细胞因子、驱动因子、生长因子以及其他的炎症标记物。
六、结论
细胞因子可以用于识别哪些患者可以从激素治疗中获益。IL3/IL6和CCL4组合的三联细胞因子可以识别大部分患者，他们应用激素治疗可以明显提高28天生存率。对于高于阈浓度的患者来说，激素治疗患者的细胞因子浓度较非激素治疗患者下降更多。这个观点与既往的观点相同：有些感染性休克患者的细胞因子水平明显升高，激素治疗可能通过调节免疫应答来实现对这类患者的治疗作用。
